صفحه اصلی خواندنی های تخصصی کلیفرم ها ( قسمت دوم )


کلیفرم ها ( قسمت دوم )

فرستادن به ایمیل چاپ مشاهده در قالب PDF

باکتری های نشانگر

شناسایی باکتری های نشانگر یکی از بهترین راه ها برای ارزیابی کارائی روش های گندزدائی آب، است مهمترین باکتری های نشانگر به ترتیب اهمیت شامل اشرشیاکلی، سایر کلیفرم های گرماپای و کلیفرم ها می باشند. وجود این باکتری ها در آب نشان دهنده ناکافی بودن فرآیند تصفیه  و همچنین آلودگی متناوب و اخیر آب با مدفوع انسان و حیوان است. کلیفرم های گرماپای به غیر از اشرشیاکلی می توانند از طریق آب های آلوده با فاضلاب صنعتی، گیاهان در حال فساد و خاک نیز وارد آب شوند. در تعیین منشاء آلودگی آب با مدفوع و ارزشیابی کارائی روش های گندزدائی آب می توان به عنوان یک نشانگر اضافی از استرپتوکک های مدفوعی  و کلستریدیوم های احیاء کننده سولفیت نیزاستفاده نمود. کلستریدیوم ها در مقایسه با کلیفرم ها و استرپتوکک ها نسبت به عوامل فیزیکی و شیمیایی مقاوم تر هستند و اسپور آن برای مدت  طولانی در آب باقی می ماند. بنابر این حضور آن درآب نشان دهنده وقوع آلودگی در گذشته و همچنین ناکافی بودن فرآیند تصفیه است. به هر حال استفاده از باکتری های نشانگر اضافی به عنوان روش کنترل روزمره توصیه نمی شود و استفاده از کلیفرم ها به دلیل سرعت و سهولت جدا سازی و شناسایی، مناسب تر است.

یادآوری- باید توجه داشت که عدم حضور کلیفرم ها و سایر باکتری های نشانگر در آب دلیل قابل شرب بودن آن نیست زیرا آب ممکن است به سایر عوامل بیماری زا مانند ویروس ها، تک یاختگان و کرم ها آلوده باشد مگر آن که فرآیند تصفیه بطور کامل و مطلوب انجام شده باشد.

یادآوری 1- در مواردی که نمونه از نظر کلیفرم مثبت است نمونه برداری باید تکرار شود

.یادآوری 2- درکلیه موارد میزان تیرگی آب بايد حداکثر پنج (NTU  ) و PH بین 5/6 تا 9 باشد همچنین میزان کلر آزاد باقیمانده پس از حداقل نیم ساعت زمان تماس در شرایط عادی (در انتهای شبکه آب رسانی ) باید 8/0 – 5/0 میلی گرم در لیتر و در شرایط اضطراری همه گیری بیماری های روده ای  یک میلی گرم  در لیتر باشد.

ویژگی های باکتریولوژیکی آب استخرهای شنا / ویژگیهای باکتریولوژیکی آب شنا استخرهای شنا باید با جدول زیر مطابقت داشته باشد.

جدول - ویژگی هاي باکتریولوژیکی آب استخرهای شنا

ردیف

نوع باکتری

حد مجاز تعداد باکتری

روش آزمون

1

کل کلیفرم ها

460 در 100 میلی لیتر

استاندارد ملی ایران به شماره 3759

2

اشرشیاکلی

100 در 100 میلی لیتر

استاندارد ملی ایران به شماره 3759

3

استرپتوکک های مدفوعی

100 در 100 میلی لیتر

استاندارد ملی ایران به شماره 3620

4

باکتری های هوازی مزوفیل[1]

200 در هر یک میلی لیتر

در دست تدوین

5

سودوموناس آئروژینوزا

منفی در 100 میلی لیتر

استاندارد ملی ایران به شماره 3140

 

یادآوری- میزان PH آب استخرهای شنا باید بین 2/7  تا 8 و میزان کلر باقیمانده آزاد بین 1 تا 5/3 میلی گرم باشد.

 

       نوع و نحوه آزمایشات کنترل کیفی

-      محیط های کشت های میکروبی :

1- محیط کشت لاکتوز براث Lactose broth

این محیط به منظور استفاده برای تشخیص کلیفرم ها در آب و فاضلاب بکار برده می شود این محیط از نظر شکل فیزیکی مایع بوده که در لوله های آزمایش تقسیم می شود .

پودر حاضر توسط کارخانه سازنده تهیه شده و به بازار عرضه گردیده است این محیط در دو غلظت   ضعیف وقوی (13گرم درلیتر و 26 گرم در لیتر)تهیه و مورد استفاده قرار می گیرد  پس از تهیه محیط کشت در غلظت های یاد شده آن رادر لوله های آزمایش بزرگ دورهام دار به مقدار 10 میلی لیتر(قوی)و در لوله های متوسط بقدار 10 میلی لیتر (ضعیف) تقسیم می نمایند و پس از مسدود نمودن درب لوله هاباپنبه ودر پوش آلومینیومی آنها را در ظرف مناسب( سبد سیمی) قرار داده و در اتوکلاو در درجه حرارت 121 درجه سانتیگراد بمدت 15 دقیقه آنهارا استریل نموده پس از سرد شدن در یخچال نگهداری می شود لوله ها ئیکه به این منظور تهیه شده اند باید طوری انتخاب شوند که پس از ریختن محیط کشت درون آنه بمقدار لازم بیش از نصف لوله را اشغال ننماید 

2- محیط کشت برلیان گرین بیل براث Brilliant green bile broth  2%

این محیط کشت نیز جهت آزمایش تائیدی آب و فاضلاب استفاده می شود رنگ این محیط سبز است و به آن محیط کشت سبز درخشان نیز می گویند این پودر توسط کارخانه های سازنده تهی گردیده و در بازار موجود است برای تهیه محیط آماده مقدار 40 گرم پودحاضر را در یک لیتر آب مقطر حل کرده ودر لوله های متوسط دورهام دار بمقدار 10 میلی لیتر پس از پنبه گذاری وغلاف آلومینیومی در حرارت 121 درجه سانتی گراد بمدت 15 دقیقه آن را استریل نموده و در یخچال نگهداری می کنیم این محیط بصورت مایع باشد

3-محیط کشت E.M.B (Eosin Methylen Blue Agar)

این محیط جهت کشت اختصاصی کلیفرمها مناسب است محیطی  جامد به رنگ بنفش و کلنی های  E.coli روی این محیط به رنگ سبز مایل به بنفش یا جلای فلزی ظاهر می شود که به وضوح قابل رویت است پودر آماده توسط کارخانه های سازنده تهیه شده و به بازار ارائه گردیده است طبق دستور کارخانه سازنده مقدار لازم از پودر مزبور رادر یک لیتر آب مقطر ریخته آن را بخوبی مخلوط نموده سپس آن را حرارت داده تا آگار آن بخوبی حل شود .

آن را در اتوکلاو بمدت 15 دقیقه و حرارت 121 درجه سانتی گراد استریل کرده پس از سرد شدن تا حدود 45 درجه سانتی گراد بقدار 25 میلی لیتر در پلیت های استریل شده تقسیم نموده پس از خنک شدن  و منعقد شدن محیط آن را به صورت وارونه در یخچال نگهداری نمائید از این محیط جهت کشت خطی و تشخیص ای کلی و کلبسیلا استفاده می شود

4- محیط کشت آردوآ آگارR2A.Agar

این محیط کشت برای روشspread plate وpour plate  استفاده می شود. این محیط کشت با مواد مغذی کم شمارش کلنی بیشتری را نسبت به محیط کشت با مواد مغذی زیاد نشان می دهد .

 pHرا با محلول k2hpo4یا kh2po4 جامد قبل از اضافه کردن آگار در حد 2/7 تنظیم می کنند. برای حل شدن آگار محیط کشت را حرارت داده و در 121 درجه ی سلسیوس به مدت 15 دقیقه سترون می کنیم                                   

                                                                                                                                                                                     

روش های انجام آزمایشات کنترل کیفی

شمارش احتمالی کلیفرم ها(most probable number)M.P.N

اندیس M.P.N با استفاده از روش چند لوله ای : گروه کلیفرمها باکتریهای هوازی و بیهوازی اختیاری- گرم منفی- بدون اسپور و میله ای شکل هستند که قادرند لاکتوز را در فاصله 48 ساعت در حرارت 5/+ - 35 درجه سانتی گراد تخمیر نموده و ایجاد گاز نمایند. آزمایش کلی فرم ها را به دو روش لوله های تخمیری شامل آزمایش های احتمالی – تائیدی-  تکمیلی انجام داد و یا با روش ممبران فیلتر که در این صورت کلی باکتری های هوازی و بیهوازی اختیاری گرم منفی بدون اسپور – میله ای شکل که قادرند کلنی های تیره رنگ در فاصله 24 ساعت روی محیط کشت  Endo agarکه لاکتوز اضافه شده تولید نماید.

آزمایش استاندارد M.P.N

1-   تست احتمالی Persumptive test

محیط کشت مورد استفاده لاکتوز براث می باشدکه پودر حاضر بصورت تجارتی در بازار وجود دارد آن را برابر دستورالعمل کارخانه سازنده تهیه نموده در لوله های آزمایش تقسیم کرده و در هر لوله یک لوله دورهام بصورت وارونه داخل آن قرار می دهیم و آن را استریل کرده و در یخچال نگهداری می کنند.

روش آزمایش:  انجام آزمایش با روش 9 لوله ای می باشد.

ابتدا سه لوله از محیط های کشت لاکتوز براث قوی( 26/gr/lit) که حاوی 10 میلی لیتر محیط کشت لاکتوزبراث در سمت چپ جا لوله آزمایش قرار می گیرد پس از آن شش لوله دیگر از محیط کشت لاکتوز براث ضعیف (13/gr/lit) هر لوله محتوی 10 میلی لیتر محیط کشت در کنار آنها قرار دارده و از نمونه مورد آزمایش که به صورت استریل تهیه شده و آن را به خوبی مخلوط نموده ایم و به صورت یکنواخت در آمده است با پیپت استریل به ترتیب از چپ به راست در هر یک از سه لوله اول 10 میلی لیتر نمونه اضافه کرده و به هر یک از سه لوله بعدی یک میلی لیتر و به هر یک از سه لوله آخر 1/0 میلی لیتر نمونه مورد آزمایش اضافه کرده کلیه این عملیات باید در شرایط استریل و با دقت انجام شود که از آلودگی های ثانوی مبرا باشد. لوله ها کمی به آرامی حرکت داده تا نمونه و محیط مخلوط شود در لوله های دورهام نباید هیچگونه گاز یا حبابی از هوا وجود داشته باشد سپس آن را در اتو 5/0+ - 35 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت قرار می دهیم

     در صورتیکه در تمام لوله های دورهام گاز تولید شده باشد آن را مثبت تلقی کرده و اگر تعدادی یا همه آنها فاقد گاز بودند آن را برای مدت 24 ساعت دیگر در اتو باقی می گذاریم پس از انقضا مدت مجدداٌ لوله ها را بازدید کرده و موارد مثبت یا منفی را یادداشت می نمایند , وجود گاز پس از 48 ساعت دلیل بر مثبت بودن آزمایش است و اگر در هیچ یک گازی مشاهده نشد آزمایش احتمالی منفی است, در مورد تخمین تعداد کلیفرم در صورت مثبت بودن برای 100 میلی لیتر نمونه آب به جدول مربوطه مراجعه نموده و تعداد احتمالی کلیفرم را تعیین می نمائیم باید توجه داشت زمانی آزمایش مثبت از اطمینان بیشتر برخوردار است که در اکثر لوله ها گاز تولید شده باشد.

نحوه گزارش: پس از استخراج عدد M.P.N  از جدول مراتب عیناٌ گزارش می گردد. بطور مثال اندیسM.P.N در نمونه مثلاٌ   A برابر است با 11 که معنی و مفهوم آن این است که محتمل ترین تعداد در 100 میلی متر نمونه 11 باکتری می باشد. چنانچه جدول در اختیار نداشته باشیم و یا شمارش مثبت ها با جدول مطابقت نکند (در جدول نگنجد) می توان از این رابطه مقدار M.P.N را محاسبه نمود:

تعداد لوله های مثبت ضربدر 100 تقسیم بر رادیکال مضروب میلی لیتر نمونه در لوله های منفی و میلی لیتر نمونه در تمامی لوله ها

    2- روش آزمایش تاییدی : در این روش از محیط کشت Brilliant green bile broth استفاده می شود این محیط را نیز طبق دستور کارخانه سازنده در لوله های آزمایش حاوی دورهام و محیط کشت مزبور که قبلاٌ تهیه و استریل گردیده استفاده می شود . انجام آزمایش تاییدی منوط به مثبت بودن آزمایش M.P.N  است که در مقابل هر لوله مثبت لاکتوز براث حاوی گاز در لوله دورهام آن یک لوله برلیان گرین در مقابل آن قرار داده و در شرایط استریل و با دقت یک تا دو قطره از محیط لاکتوز براث مثبت به محیط کشت برلیان گرین بیل براث اضافه نموده آن را در دمای 5/0 +-35 به مدت 48 ساعت در انکو باتور قرار داده در صورت ایجاد گاز در لوله های دور هام محیط کشت برلیان گرین آزمایش مثبت تلقی شده یعنی مراحل قبلی تا یید می گردد .

     3-  آزمایش تکمیلی   Completed test

این آزمایش نیز پس از مثبت بودن آزمایش تاییدی انجام می گیرد  

   روش آزمایش : از کلیه لوله های مثبت در آزمایش تاییدی به صورت روش خطی بر روی محیط کشت  E.M.B کشت داده می شود پس از انجام کشت آن را برای مدت 2+ - 24 ساعت در اتو 5/0 + - 35 درجه سانتی گراد قرار داده کلو نی های رشد کرده روی این محیط شکل های  1-مشخص 2- غیر مشخص 3 - منفی تقسیم می شود

1- کلنی های مشخص  Typical  به صورت هسته دار و جلای فلزی یا بدون جلای فلزی می باشد

2-   کلنی های غیر مشخص بدون هسته با رنگ مات که بعد از 24 ساعت صورتی رنگ می شوند  

3-  سایر کلنی های موجود منفی تلقی می شود در بیان نتایج لا مشاهده کلنی های هسته دار با جلای فلزی گزارش اشیرشیا کلی ودیدن کلنی های صورتی رنگ روی این محیط کلبیسلا گزارش می شود برای اطمینان بیشتر  از هر جعبه پتری محتوی کشت یک یا چند کلنی مشخص انتخاب کرده در یک لوله محتوی محیط لاکتوز براث حاوی لوله دورهام کشت داده و قسمتی نیز روی محیط کشت Natural Agar   پس از مدت 24 تا 48 ساعت در اتو 35 درجه سانتی گراد لوله های حاوی لاکتوز براث دارای گاز در لوله دورهام مثبت تلقی می شود واگر از محیط کشت نوترین آگار فروتی تهیه شود وآن را با رنگ گرم رنگ آمیزی نمائید وجود باسیل های گرم منفی بدون اسپور دلیل بر وجود کلی فرم ها می باشد در این صورت آزمایش تکمیلی مثبت است.

اعلام  نتیجه آزمون میکروبی :

در آزمایشگاه  میکروبی آب و فاضلاب روستائی کلیفرم گرماپای با واحدml100 / MPN  احتمالی  و تاییدی بیشتر از 2/2  و نوع میکروب E.coli   یا kellebsilla گزارش می شود و در صورت عدم  تولید گاز و بون تغییر ماندن رنگ در مرحله احتمالی یا احتمالی عدم وجود کلی فرم ها گزارش می شود

همچنین در اعلام نتایج آزمون میکروبی تعداد جمعیت میکروبی (HPC) با واحد (cfu/ml  ) گزارش می گردد. که در صفحه بعد نوع محیط کشت و روش اجرائی بیان می گردد                               

آزمایش HPC (شمارش میکرو ارگانیسم های هترو تروف)

شمارش میکرو ارگانیسم ها ی هتروتروف که پیش از این تحت عنوان شمارش پلیت استاندارد شناخته می شد – روشی است که توسط آن تعداد باکتری های  هتروتروف زنده در آب اندازه گیری شده و جزء تغییرات کیفی به هنگام تصفیه و توزیع آب و یا کیفیت آب استخرهای شنا بررسی می گردد . کلنی های مورد مطالعه با این روش می توانند به صورت دوتایی – زنجیره ای- خوشه ای و یا منفرد تشکیل شوندکه همه انواع آن تحت عنوان واحد های تشکیل دهنده کلنی (CFU ) نامیده می شوند .شمارش نهایی به مقدار موثر انتشار کلنی بستگی دارد از این رو روش کار و محیط کشت به گونه ای باید انتخاب شود که بتواند بیشترین تعداد کلنی را در مدت معینی از گرماگذاری تولید کند در حال حاض سه روش و 4 محیط کشت وجود دارد که بیان می گردد:

روش های 1- پور پلیت 2- کشت سطحی یا اسپرید پلیت 3- صافی غشایی یا ممبران فیلتر

محیط های کشت : Plate count agar-1 2-m HPC Agar   3-R2A Agar 4- NWRI Agar(HPCA)

روش پورپلیت : مقدار1/0 تا 1 میلی لیتر از نمونه یا نمونه ای رقیق شده که به وسیله ی پیپت به پلیت سترون اضافه و سپس محیط کشت آگار مذاب را می افزاییم و پس از مخلوط شدن باید سرد و منجمدگردد سپس گرماگذاری شده و شمارش کلنی انجام می گردد.

روش کشت سطحی : مقدار 1/0 یا 5/0 میلی لیتر از نمونه یا 1/0 یا 5/0 میلی لیتر از رقت مناسب نمونه به محیط کشت حاوی آگار جامد شده موجود در پلیت اضافه می شود . نمونه ی تلقیح شده  بر روی سطح محیط کشت را با یک میله شیشه ای سترون به صورت یکنواخت پخش می گردد.در این روش همه کلنی ها بر روی سطح محیط کشت به وجود آمده و مانع از نفوذ کلنی ها به داخل آگار مذاب می شود . پس از گرماگذاری در دما زمان مناسب – کلنی های باکتری ها را بر روی سطح آگار شمارش می نمایند

روش صافی غشایی : این روش در مورد نمونه های آب با حجم زیاد و کدورت کم و معمولاٌ برای آب هایی با احتمال شمارش کلنی (کمتر از Cfu/ml 10- 1) به کار می رود این روش شوک گرمائی ایجاد نمی کند و هزینه های آن برای تهیه صافی های غشایی بیشتر از دو روش  دیگر برشمرده می شود

 

روش کشت سطحی (Spread Plate):

1- پلیت ها را به ترتیب چیده و علامت گذاری می نمائیم .پلیت شاهد – دو سری پلیت برای هر نمونه مورد آزمایش و نمونه کنترل مثبت برای یک سری از نمونه ها تهیه می کنیم. برای کنترل شرایط سترون از 1/0 میلی لیتر آب رقیق سازی سترون استفاده می گردد.این کار برای اطمینان از سترون بودن پیپت – آگار ورقیق سازی انجام می گیرد

2-   نمونه ها را رقیق سازی می نمائیم

3-    براساس نمونه ها و رقت ها پلیت ها را مرتب می نمائیم

4- نمونه هاو رقت ها را قبل از اینکه با استفاده از پیپت به داخل پلیت منتقل کنیم بایستی به شدت تکان داد

5-  در حالی که پلیت را می چرخانید نمونه یا حجم رقیق شده (1/0 یا5/0 میلی لیتر رابا استفاده از پیپت روی سطح محیط آگار جامد می ر یزیم

6-  نمونه تلقیح شده را روی سطح محیط کشت با استفاده از میله شیشه ای سترون به طور یکنواخت پخش کنید این کار با ثابت نگه داشتن میله شیشه ای بر روی سطح آگار و حرکت دادن پلیت و یا با حرکت دادن میله شیشه ای بر روی سطح محیط کشت انجام می شود در این روش همه کلنی ها بر روی سطح محیط کشت شکل می گیرند

7-   قبل از گرماگذاری اجازه می دهیم تا نمونه تلقیح شده بطور کامل در محیط کشت جذب شود

8-  وقتی سطح محیط کشت آگار خشک شد درب پلیت ها را بسته آنها را بطور وارونه برای انجام آزمایش های اختصاصی به مدت 48 ساعت در  حرارت 35 درجه سلسیوس قرار می دهیم پس از گرماگذاری در دما و مدت زمان مناسب کلنی های مجزا بر روی سطح محیط کشت پدیدار می شوند

محاسبه و گزارش نتیجه ی آزمایش:

برای محاسبه ی شمارش پلیت – کل کلنی های شمارش شده و یا میانگین آن ها(در موردپلیت های دوتائی از یک ضریب رقت یکسان ) در هر پلیت در عکس ضریب رقت ضرب می شود. بهتر است ابتدا تا دو رقم معنی دار (دو رقم سمت چپ ) گرد شده سپس بصورت Cfu/ml گزارش شود.

MPN/100

تعداد لوله های مثبت

< 2.2

0

2.2

1

5.1

2

9.2

3

16

4

> 16

5

جدول 1- جدول راهنمای تعیین MPN پنج لوله ای(برای نمونه های آب چاه)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

نتیجه گیری

به طور کلی اشرشیاکلی، علت شایع مسمومیت غذایی است. برخی از گونه‌های آن به صورت طبیعی در روده حیوانات و انسان یافت می‌شود. حدود صدها گونه از اشرشیاکلی وجود دارد که بیشتر آن‌ها همان‌طور که اشاره شد، مضر هستند.
این باکتری از طریق دست‌های آلوده به مدفوع، آب‌های آلوده، گوشت‌های خام و شیر و آب‌میوه غیر پاستوریزه منتقل می‌شود نقش این نکات بسیار مهم است چون به راحتی می‌توان با یک شستشوی ساده  با آب و صابون یا شستشوی مواد غذایی قبل از مصرف جلوی این مسأله را گرفت. کالباس، سوسیس، گوشت نیمه پخته‌شده و کاهو نیز این باکتری را منتقل می‌کنند. پس از ورود باکتری از طریق دهان، این باکتری وارد روده‌ها می‌شود و به سلول‌های مخاط روده‌ می‌چسبد و شروع به تکثیر می‌کند و هنگامی که تعداد آن‌ها زیاد شود، همگی شروع به آزاد کردن سم می‌کنند. سم ناشی از باکتری‌ها، مخاط روده را تخریب و دردهای شدید شکمی و اسهال را ایجاد می‌کند.

 منبع:

آژانس خبری غذایی 

 

 

آخرین بروزرسانی ( دوشنبه, 07 آذر 1390 ساعت 13:25 )